为什么日本的街上可以有那么多走路上学的孩子-大国春秋
来源：谈资有营养（tanzifeed）
2014年，樱花飘落的4月盘索里，日本兵库县相生市一个6岁的小朋友，竹内海，正式成为一名光荣的一年级小学生。比全校同学都特殊的是，这名6岁的小学新生，被安排有一辆接送自己每天上下学的“专车”，免费，当地教委商议后决定，他能一直乘坐这辆车直到初中毕业。
竹内海的家在相生市坪根地区，坪根离市区大约7公里乞儿弄蝶，常住居民大约只有70人，以养殖螃蟹为主业。当地只有一条路通往市区陈毅锋，中途还要经过狭窄的隧道。由于路况不好，只能前往市区上学的当地孩子们，数十年来一直乘船从海路上下学。然而由于生育率的持续下降那广子，从2010年开始，连乘船上学的孩子也没有了，因而这条航路停止运行，直到6岁的竹内海成为坪根地区3年来的首个小学新生。
作为全市学生通学免费计划的一部分，市教委决定每年拨出专项预算，为竹内包一辆出租车（专门开通校车成本太高）盈科数码，每天从他家附近的当地集会场所出发，行驶大约15分钟，开到距离学校大约500米的公交车站，然后他再步行去学校。放学后的路线则与此相反。
小学生竹内海的上下学路，放眼全日本中森名菜，也算是独一无二。而之所以为其提供这样的便利，除了让我们看到日本社会对基础教育的用心程度，还有一个跟接受知识同样重要的原因——培养小朋友的独立性。其中一个做法就是，让他们独自上下学。
日本的小学生，从上学第一天的入学式开始，就会被告知应该自己独立上下学的要求。小小一只，背着方正的大书包，戴上学校发放的颜色醒目的帽子，6、7岁的孩子们三五成群，或是独自一人穿梭在人潮中上下学，这是日本街头一道常见的风景。对于孩子们来说，也是正式成为一名独立勇敢的小学生的标志。
跟风雨无阻接送孩子的中国父母不一样的是，日本家长们的普遍认知是，从自己的孩子进入小学一年级开始，就不需要再接送了。有些学校也会特别在校规中规定不让父母接送孩子于小彤海陆。而在这条上学路上，他们唯一能做的，就是在第一天的入学式结束以后北岛康介 ，认真地教给自己的孩子怎么上下学，走哪条路最安全。
不过尽管没有家长的守护，也不代表从学校到家之间的路途中，小学生们就被完全地“放养”。在无忧无虑的上下学背后，其实有着来自整个日本社会的善意关照。
在日本的街头，常常看到走路的小学生，大部分学校都要求孩子们走路上下学，校车是幼儿园的专属（当然也有不少幼儿园是由老师带领步行上学的）。
日本的小学也按片区招生，只不过目的跟我们不一样，学校大多是根据当地人口密度来建立的，这样可以保证绝大多数本区域的孩子只要步行15到20分钟就能到达学校。因此跨区域入学的几乎没有，除非是学生中途搬家去了别处，但仍想在原来的学校上学。不过这样的跨区入学森重宽，学校会对其进行极其严格的审批，小朋友还得证明自己能够独立步行或乘坐电车、地铁等交通工具，否则就只会被劝转校。
但其实转校也不用担心，因为日本从二战以后就十分注重“公平教育”，不同区的小学，哪怕是乡下的小学，教育设施和师资力量都是同等的。日本滋贺县的一个小岛冲岛上，有且仅有一所小学“近江八幡市立沖岛小学校”，这个学校今年被报道时全校只有13个学生，却拥有完整的令人羡慕的教学设施：电子化的教室（电子黑板、投影仪、52英寸电视）、室内体育馆、室外体育馆、50米长的标准游泳池、拥有6台显微镜和1台高倍望远镜的科学实验室、配备了钢琴的音乐教室、馆藏5000册图书的图书馆、以及一个小农场。
日本的中小学被严格禁止实施精英教育，没有重点非重点学校之分铜仁一中 ，也没有快慢班之分，虽然学校外也有各种竞争激烈的私塾补习班，但学校的老师被明确禁止给学生开小灶，有意偏爱或冷落某个学生，遭到投诉后也会遭到严厉的处罚。尤其日本的户口也可以随便迁移，无论是农村的孩子想到城市上学，或是城市的孩子转校到农村，都不是什么麻烦事，残疾学生和外国人学生也遵从这个“就近上学”的原则。
小学生的上学路不会太长，在这段路上，学校和家长也会不厌其烦地教育孩子们充分发挥互帮互助精神，离校近的孩子可以独自前往，离校稍远的，大家会约定几个顺路的集合点，小朋友从家出发，到一个集合点跟同学汇合，再一起前往下个集合点，要是时间合适，到达学校的的队伍总是浩浩荡荡一群人，其中不乏好几个是4年级以上的“前辈”，而这种结伴方式一般都是自发的。
同学们自愿约定的集合点，一般是在由政府标注的“通学路”上。政府会根据学生数量，和这一区学生上学的顺路情况，划分“通学路”，在学生多的通往学校的路上标注不同的标志，对汽车司机发布限速的警示。甚至不少通学路上在上下学高峰期还有定时限行的要求。
同时小学的大门口和通学路上，是警察防止犯罪活动的重点巡逻区域。日本小学生的学生守则里也因此对学生作出要求：“上学放学时走规定的路线，靠右行，不要绕道和买零食。”（尽管有的小朋友还是会去便利店买炸鸡汽水和扭蛋。）
学校也会在上下学时间段派遣“学童拥护员”王翊丹 ，在学校周边车流量较大的路口引导学生们过马路。他们之中有些是自发组织的学生家长，有些是住在学校附近的小区居民，举着醒目的黄色小旗帜站在道路中间，阻挡过往车辆，指导学生们有序地通过人行横道。
一些路面宽阔、且车流量较大的的人行横道两边，红绿灯灯柱上还会放有免费供人使用的阻挡车辆的小旗帜，小学生们独自过马路时可以取用，热心的路人有时也会拿着小旗帮助孩子们一起过马路。
至于路面较窄，没有红绿灯的路口，过马路也很安全，日本的汽车是无条件给行人让路的，尤其是小学生。之前有个很火的视频，一个日本小女孩过马路，汽车停下来让行，女孩在路中间时给司机鞠了一躬。这不是摆拍，就是真实存在的日常。
除此以外，小学生们自身的防护装备也值得一提。日本的学校在开学第一天会给每个孩子发一顶小帽子，被称为“通学帽”，一般是黄色，因为颜色鲜艳，可以唤起车辆，路人注意，来确保学生的路上安全。
还有小学生的书包，之前有新闻报道日本小学生的书包，一个要花人民币5000元，具备有防摔倒等功能。虽然也有这样的书包存在，但大部分小学生书包其实是可以自由选择的，价格有高有低，但都满足轻便、结实的特点，跟其他阶段学生书包不同的是，小学生书包的正面一定会设计特别醒目的反光带，就算是在夜间行走，也可以起到很好的警示司机和路人的效果。加上近几年，很多日本公司开始推出安装在书包上的GPS定位器，如果遇到危险葛粉的吃法，公司和学生家长也能马上定位孩子所在位置。
当然，在日本小学生们安全的上下学路中，最重要的还是，一代代累积下来的，日本成年人对爱护未成年人的自觉，被整个社会重视着的孩子，受陌生人关爱长大的孩子，长大以后，也就自然而然成为关爱孩子的大人。这样一代代培养起来的社会风气，可能也就自然促成了日本在全世界数一数二的良好的社会治安。
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摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取陈敬宣，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNAforward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggtggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactgaccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%)Total RNAs Percent (%) Total39,813100 6,194,289100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA2,1245.33 22,289 0.36 snoRNA190.05 1830.00 other10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,14440.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved NovelConserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40miR-1992, miR-2b, miR-34,Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1)miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20,何雨婷 Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据口罩姬，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega
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